معرفی تکنیک Real-time PCR

 این فرآیند تکثیر DNA واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) را با نظارت در زمان واقعی واکنش ترکیب می‌کند که امکان اندازه‌گیری توالی‌های DNA خاص را در حین تقویت آنها فراهم می‌کند. همانند PCR سنتی، ریل تایم PCR نیز شامل چرخه‌های مکرر گرمایش و خنک‌سازی برای دناتوره کردن DNA، انلینگ پرایمرها و گسترش رشته DNA، ایجاد کپی‌هایی از بخش DNA هدف است. Real-time PCR از رنگ‌های فلورسنت یا پروب‌هایی استفاده می‌کند که به DNA متصل می‌شوند و اجازه می‌دهند تجمع محصول تقویت‌شده پس از هر چرخه اندازه‌گیری شود. شدت فلورسانس به نسبت مستقیم با مقدار محصول PCR تولید شده افزایش می یابد.

اهمیت در زیست شناسی مولکولی

Real-time PCR می تواند مقدار اولیه DNA یا RNA موجود در یک نمونه را با دقت بالا تعیین کند، که برای تجزیه و تحلیل بیان ژن، تعیین بار ویروسی و کمی سازی مواد ژنتیکی بسیار ارزشمند است. بسیار حساس است و می‌تواند سطوح بسیار پایین DNA هدف را تشخیص دهد، که آن را برای تشخیص بیماری‌های عفونی، تشخیص جهش‌های کم فراوانی و آنالیز نمونه‌های کوچک در مطالعات پزشکی قانونی و محیطی ضروری می‌سازد. ریل تایم سریعتر از روش های PCR سنتی است زیرا تقویت و تشخیص را در یک مرحله واحد ترکیب می کند و زمان کلی از آماده سازی نمونه تا تجزیه و تحلیل نتیجه را کاهش می دهد.

دارای محدوده دینامیکی وسیعی است که می تواند اهداف را در چندین مرتبه بزرگی شناسایی و تعیین کند و تجزیه و تحلیل نمونه هایی با غلظت های DNA یا RNA بسیار متفاوت را تسهیل کند. Real-time PCR را می توان در زمینه های مختلف از جمله تشخیص بالینی، تحقیقات، بیوتکنولوژی و نظارت بر محیط استفاده کرد. از آن در تشخیص پاتوژن ها، نظارت بر پیشرفت بیماری، تایید نتایج ویرایش ژن و موارد دیگر استفاده می شود. در تشخیص بالینی، آزمایش غیر تهاجمی را از طریق تشخیص مواد ژنتیکی در خون، بزاق یا سایر مایعات بدن امکان پذیر می کند و نیاز به روش های تهاجمی را کاهش می دهد.

به طور خلاصه، Real-time PCR به دلیل توانایی آن در تعیین کمیت سریع و دقیق اسیدهای نوکلئیک، حساسیت و ویژگی بالای آن، و طیف وسیعی از کاربردهای آن در تحقیقات علمی و تشخیص بالینی، یک تکنیک سنگ بنای در زیست شناسی مولکولی است. توسعه آن انقلابی در زمینه زیست شناسی مولکولی ایجاد کرده است و امکان انجام تجزیه و تحلیل ژنتیکی و تشخیص دقیق را فراهم می کند که با تکنیک های مولکولی قدیمی تر امکان پذیر نبود. PCR سنتی و PCR کمی هر دو تکنیک‌هایی هستند که برای تکثیر DNA استفاده می‌شوند، اما در روش‌شناسی، جمع‌آوری داده‌ها و کاربردهایشان تفاوت چشمگیری دارند.

PCR

PCR سنتی DNA را تقویت می کند اما در طول فرآیند آن را کمیت نمی کند. تشخیص و تجزیه و تحلیل DNA تکثیر شده پس از تکمیل فرآیند PCR، معمولاً از طریق الکتروفورز ژل انجام می شود. در درجه اول داده های کیفی را ارائه می دهد که نشان دهنده وجود یا عدم وجود یک توالی DNA خاص در نمونه است. نتایج به صورت نوارهایی روی یک ژل، با حضور نواری که نشان دهنده تقویت موفقیت آمیز DNA هدف است، مشاهده می شود. در حالی که PCR سنتی در تشخیص DNA حساس است، کمیت دقیق را ارائه نمی دهد. تجزیه و تحلیل کمی خشن است و عموماً دقت کمتری دارد و اغلب به مراحل یا روش‌های اضافی نیاز دارد.

Real-Time PCR

ریل تایم PCR امکان تعیین کمیت DNA را در طول فرآیند PCR فراهم می کند. از نشانگرهای فلورسنت برای نظارت بر تقویت DNA در زمان واقعی استفاده می کند، با سیگنال فلورسانس متناسب با مقدار محصول PCR تولید شده افزایش می یابد. داده های کمی را در مورد مقدار اولیه DNA در نمونه ارائه می دهد و امکان محاسبه تعداد دقیق کپی های DNA را فراهم می کند. از آنجایی که آنالیز در زمان واقعی انجام می شود، نیازی به الکتروفورز پس از PCR یا سایر روش های آنالیز پایین دستی نیست، و زمان و پتانسیل آلودگی را کاهش می دهد. Real-time PCR بسیار حساس و اختصاصی است و قادر به تشخیص و تعیین کمیت حتی مقادیر کمی از DNA است. همچنین می‌تواند بین توالی‌های DNA نزدیک به هم تمایز قائل شود و آن را برای تشخیص جهش‌ها یا گونه‌های خاص ایده‌آل می‌کند.

تمایزات کلیدی

جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل داده‌ها: PCR سنتی در نقطه پایانی آنالیز می‌شود، به این معنی که نتایج را تنها پس از تکمیل چرخه‌های PCR دریافت می‌کنید. در مقابل، ریل تایم PCR داده‌ها را در طول فرآیند PCR فراهم می‌کند و امکان نظارت دینامیکی بر تقویت DNA را فراهم می‌کند. Real-time PCR مقدار DNA را اندازه‌گیری می‌کند و داده‌های تجمعی دقیق و بی‌درنگ را ارائه می‌کند، در حالی که PCR سنتی یک ارزیابی کیفی یا نیمه کمی پس از تقویت را فراهم می‌کند.

Real-time PCR به طور کلی سریعتر و کارآمدتر است، زیرا تقویت و تشخیص را در یک مرحله ترکیب می کند و نیاز به پردازش پس از تقویت را از بین می برد. به طور خلاصه، در حالی که هر دو تکنیک PCR سنتی و ریل تایم PCR DNA را تقویت می‌کنند، ریل تایم PCR مزایایی از جمله افزایش حساسیت و ویژگی، و گردش کار ساده‌تر را ارائه می‌دهد. این ویژگی‌ها، ریل تایم PCR را به ابزاری قدرتمند برای تجزیه و تحلیل ژنتیکی، تحقیقاتی و کمی تبدیل می‌کند.

نشانگرهای فلورسنت

نشانگرهای فلورسنت نقش مهمی در ریل تایم PCR ایفا می‌کنند و امکان تشخیص و تعیین کمیت DNA را در طی فرآیند PCR تقویت می‌کنند. این نشانگرها هنگامی که به DNA متصل می شوند، فلورسانس ساطع می کنند و شدت این فلورسانس متناسب با مقدار DNA تقویت شده افزایش می یابد و امکان نظارت در زمان واقعی واکنش را فراهم می کند.

انواع نشانگرهای فلورسنت:

Sybr Green رنگی است که به شیار کوچک DNA دو رشته ای متصل می شود. پس از اتصال، فلورسانس افزایش یافته را نشان می دهد. Sybr Green در تشخیص روش غیر اختصاصی استفاده می شود زیرا به هر DNA دو رشته ای متصل می شود و اطمینان از اختصاصیت PCR برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب مهم است.

کاوشگرهایTaqMan :

اینها پروب های الیگونوکلئوتیدی توالی خاص هستند که با رنگ گزارشگر فلورسنت در یک طرف و رنگ خاموش کننده در طرف دیگر برچسب گذاری شده اند. در طی PCR، پروب به یک توالی هدف خاص بین پرایمرهای فوروارد و معکوس متصل می شود. پلیمراز Taq پروب را در طول فاز گسترش می شکافد، رنگ گزارشگر را از خاموش کننده جدا می کند و یک سیگنال فلورسنت متناسب با مقدار محصول تقویت شده تولید می کند.

فانوس‌های مولکولی:

 اینها مولکول‌هایی به شکل سنجاق مو هستند که در یک سر آن یک رنگ گزارشگر و در طرف دیگر یک خاموش کننده وجود دارد. هنگامی که بیکن در طی PCR به دنباله هدف خود متصل می شود، ساختار سنجاق سر مختل می شود و گزارشگر و خاموش کننده را از هم جدا می کند و فلورسانس تولید می کند. فانوس های مولکولی بسیار خاص هستند و برای تشخیص توالی های DNA خاص در یک مخلوط پیچیده استفاده می شوند.

پروب هایFRET :

انتقال انرژی تشدید فلورسانس: این پروب ها از دو رنگ فلورسنت مختلف استفاده می کنند که با یکدیگر تعامل دارند. هنگامی که یک رنگ (دهنده) توسط نور برانگیخته می شود، انرژی را به رنگ دوم (پذیرنده) منتقل می کند که سپس فلورسانس ساطع می کند. نزدیکی رنگ ها که توسط تقویت DNA هدف تعیین می شود، بر سطح انتقال انرژی و در نتیجه سیگنال فلورسانس تأثیر می گذارد.

نقش فلورسنت ها در Real-Time PCR

تعیین کمیت: نشانگرهای فلورسنت با همبستگی شدت فلورسانس با مقدار DNA، تعیین کمیت DNA را در زمان واقعی امکان پذیر می کنند. این کمی سازی برای کاربردهایی مانند تجزیه و تحلیل بیان ژن، که در آن سطح بیان ژن های خاص اندازه گیری می شود، ضروری است.

ویژگی: کاوشگرهایی مانند TaqMan و فانوس‌های مولکولی با اتصال به توالی‌های هدف خاص، ویژگی را فراهم می‌کنند و اطمینان می‌دهند که سیگنال فلورسانس با تقویت قطعه DNA مورد نظر مطابقت دارد.

تجزیه و تحلیل منحنی ذوب: تجزیه و تحلیل منحنی ذوب پس از تقویت، که توسط رنگ های فلورسنت تسهیل می شود، به تأیید ویژگی واکنش PCR با تمایز بین محصولات با دماهای مختلف ذوب کمک می کند.

به طور خلاصه، نشانگرهای فلورسنت جدایی‌ناپذیر عملکرد PCR ریل تایم PCR هستند و امکان نظارت، کمی‌سازی و تأیید تکثیر DNA را در زمان واقعی فراهم می‌کنند و در نتیجه طیف گسترده‌ای از کاربردهای زیست‌شناسی مولکولی را با دقت و ویژگی بالا ممکن می‌سازند.

دستگاه های Real-Time PCR

دستگاه ریل تایم PCR در زمان واقعی، ابزارهای پیشرفته ای هستند که برای تشخیص و کمی سازی مولکول های DNA یا RNA در نمونه های بیولوژیکی به کار میروند. این دستگاهها از فناوری PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) استفاده میکنند و قادرند تغییرات مقدار DNA یا RNA را در طول سیکل های PCR و در زمان واقعی رصد کنند. در فرآیند Real-Time PCR، ابتدا RNA مورد نظر با استفاده از آنزیم Reverse Transcriptase به DNA مکمل (cDNA) تبدیل میشود. سپس، این cDNA در سیکل های PCR تکثیر میشود و میزان تکثیر با استفاده از فلورسنت های خاصی که به DNA دو رشته ای متصل میشوند، اندازه گیری میشود. این فلورسنت ها میتوانند رنگ های غیراختصاصی مانند SYBR Green یا پروب های اختصاصی باشند که فقط به توالی های خاصی از DNA متصل میشوند.

کاربردهای Real-Time PCR بسیار گسترده است و شامل تشخیص بیماریها، بررسی بیان ژنها، تحقیقات ژنتیکی و مطالعات اپیدمیولوژیک میشود. این دستگاهها به دلیل دقت بالا، حساسیت زیاد و سرعت نسبتاً زیاد در تشخیص و کمیسازی، ابزاری قدرتمند در دست محققان و دانشمندان هستند.

مقایسه دستگاه‌های  Real-Time PCR

مقایسه دستگاه‌های Real-Time PCR شامل ارزیابی ویژگی‌های کلیدی و تمایزاتی مانند سهولت استفاده، پشتیبانی فنی و مقرون‌به‌صرفه بودن است. این عوامل برای کاربران بسیار مهم است که هنگام انتخاب تجهیزات مناسب برای نیازهای آزمایشگاهی خود در نظر بگیرند.

راحتی در استفاده

رابط کاربری: دستگاه‌هایی با رابط کاربری بصری و کاربرپسند به آموزش کمتری نیاز دارند و می‌توانند کارآمدتر کار کنند. کنترل‌های صفحه لمسی، پیمایش منوی واضح، و نرم‌افزاری که تنظیمات و تجزیه و تحلیل هدایت‌شده را ارائه می‌دهد، می‌تواند تجربه کاربر را به میزان قابل توجهی افزایش دهد. اتوماسیون: برخی از سیستم‌ها ویژگی‌های خودکار مانند بارگیری صفحه، اسکن بارکد و پروتکل‌های راه‌اندازی، کاهش خطاهای دستی و صرفه‌جویی در زمان را ارائه می‌دهند. تعمیر و نگهداری و تمیز کردن: دستگاه‌هایی که برای نگهداری و تمیز کردن آسان طراحی شده‌اند، زمان خرابی و تاخیرهای عملیاتی را به حداقل می‌رسانند و بهره‌وری آزمایشگاه را بهبود می‌بخشند.

پشتیبانی فنی

در دسترس بودن: پشتیبانی فنی خوب شامل خدمات مشتری در دسترس و پاسخگو، با کارشناسان در دسترس برای کمک به عیب یابی یا ارائه آموزش است. منابع: منابع جامعی مانند کتابچه های راهنمای دقیق، آموزش های آنلاین، پرسش های متداول می تواند به کاربران کمک کند تا به سرعت مشکلات را حل کنند و بهترین روش ها را بیاموزند.

خدمات و تعمیرات: در دسترس بودن گزینه های سرویس و تعمیر به موقع و کارآمد برای به حداقل رساندن زمان خرابی بسیار مهم است. یک توافق نامه پشتیبانی خوب ممکن است شامل خدمات منظم، تعمیرات در محل و یک خط تلفن برای کمک فوری باشد.

مقرون به صرفه بودن

قیمت اولیه خرید: هزینه اولیه دستگاه یکی از موارد مهم است. مدل های با قیمت بالاتر اغلب با ویژگی های پیشرفته و عملکرد بهتر ارائه می شوند، اما بهترین انتخاب به نیازهای خاص و بودجه آزمایشگاه بستگی دارد. هزینه های در حال اجرا: هزینه هر اجرا را در نظر بگیرید که شامل معرف ها، مواد مصرفی و نگهداری می شود. برخی از سیستم ها ممکن است قیمت خرید پایین تری داشته باشند اما هزینه های عملیاتی بلندمدت بیشتری داشته باشند.

توان عملیاتی و کارایی: دستگاه‌های با توان بالا می‌توانند نمونه‌های بیشتری را در هر اجرا پردازش کنند و به طور بالقوه کارایی بهتری را برای آزمایشگاه‌های شلوغ ارائه دهند. با این حال، آزمایشگاه‌های کوچک‌تر ممکن است متوجه شوند که دستگاهی با توان کمتر گزینه مقرون‌به‌صرفه‌تری است. نرم‌افزار و به‌روزرسانی‌ها: سیستم‌هایی که با نرم‌افزار تحلیل جامع و به‌روزرسانی‌های رایگان ارائه می‌شوند، در طول زمان ارزش بهتری ارائه می‌کنند، زیرا نیاز به خرید نرم‌افزار اضافی را کاهش می‌دهند و اطمینان می‌دهند که دستگاه با آخرین پیشرفت‌ها به روز می‌ماند.

متمایز کننده های کلیدی

انعطاف‌پذیری و مدولاریت: برخی از دستگاه‌های ریل تایم، ارتقاهای مدولار را ارائه می‌کنند، مانند کانال‌های فلورسانس اضافی یا بلوک‌های قابل تعویض برای اندازه‌های مختلف نمونه، که انعطاف‌پذیری و مقیاس‌پذیری را برای برآورده کردن نیازهای تحقیقاتی در حال تکامل فراهم می‌کنند.

کلام آخر

در نتیجه، هنگام مقایسه این دستگاه‌ها، آزمایشگاه‌ها باید سهولت استفاده، پشتیبانی فنی و مقرون به صرفه بودن را همراه با الزامات کاربردی خاص خود در نظر بگیرند. دستگاهی که این عوامل را به طور موثر متعادل می کند، می تواند کارایی آزمایشگاه را افزایش دهد، نتایج قابل اعتماد را تضمین کند و ارزش بلندمدت خوبی ارائه دهد،  شما می توانید برای دریافت مشاوره تخصصی و خرید انواع دستگاه ترمال سایکلر PCR با شرکت مولکولی ماناتک تماس حاصل فرمایید.